尊龙凯时细胞培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：生长特性为贴壁生长，冻存条件为无血清冻存液。

培养体系：基础培养基为1:1的MCDB105培养基（最终浓度15g/L碳酸氢钠）与M199培养基（最终浓度22g/L碳酸氢钠）的混合物，加入15%的优质胎牛血清和1%的双抗。传代方法建议首次进行1:2的传代，传代间隔为2天换液。备注：请使用无菌离心管收集培养基，以备对比培养之用；如对比培养效果不佳，建议直接选购尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

最佳的细胞运输处理方式是在细胞状态良好后将其灌满完全培养液，并封好瓶口。收到细胞后，喷洒75%酒精于整个细胞瓶以进行消毒，然后在超净台内进行严格无菌操作，将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态后再进行操作。通过显微镜观察细胞的生长状况，并进行不同放大倍数的拍照保存（建议各拍一张40x、100x、200x的照片），前三天的照片作为售后支持的重要依据，若未提供照片则默认为收到的细胞状态良好。传代后建议使用原瓶的完全培养基处理一瓶，同时用自己配制的培养基处理另一瓶以便进行对比培养，换液后请将瓶盖拧松。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

当细胞汇合度未超过80%时，将瓶中的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基于37℃、5% CO2的孵箱中培养；如果细胞密度超过80%，请按照以下步骤进行传代： 1. 丢弃培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次冲洗。 2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速返回操作台，轻轻敲打培养瓶后添加超过5ml的完全培养基以终止消化。 3. 轻柔吹打细胞使其完全脱落后吸出悬液，转移至离心管中在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，重悬于1-2ml的完全培养基中。 4. 按照1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（两个T25瓶），然后补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱继续培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，丢弃T25培养瓶中的培养液，使用PBS清洗细胞一次； 2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，反转观察，当细胞缩回并变圆时加入5ml完全培养液终止消化，轻柔吹打使细胞脱落，随后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟； 3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。 4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如需转入液氮罐，应先在-80℃冰箱中存放24小时以上再转移。

细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管（请务必佩戴防护面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁；将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；弃去上清，将细胞重悬于5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养；第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

某些细胞可能在运输过程中发生脱落，这是正常现象。若脱落现象较明显，可将培养瓶中的全部培养液收集至离心管，以便进行过渡培养（后期对比培养）。沉淀后加入胰酶于细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1. 关于细胞重发的情况

以下情况可申请重发： 1. 在运输途中发生细胞丢失、瓶身破损或培养液严重泄露； 2. 收寄后48小时内出现细胞污染问题，并提供实验结果； 3. 常温发货细胞静置24小时后，干冰冻存发货细胞复苏24小时后大部分细胞未存活，需提供细胞状态照片； 4. 干冰冻存发货细胞复苏24小时后或常温发货细胞静置4小时且未开封时出现污染； 5. 欲验证细胞活性问题，请在收到产品7天内提供实验结果； 6. 收到产品当天及第2、3天内请拍照，未提供则视为产品合格； 7. 在4-7天内出现问题者，需提供前三天照片及详细操作步骤，并与技术人员沟通，如判定责任属我方则进行重发。

2. 不予重发的情况

以下情况不予重发： 1. 客户造成的细胞污染； 2. 客户不当操作导致的细胞状态不良； 3. 非本库推荐的细胞培养体系导致的细胞状态不佳； 4. 无法提供细胞培养前三天照片的； 5. 细胞经过其他处理后； 6. 收到2天内未告知的； 7. 依据具体情况决定。